Данная статья описывает исследование преимплантационных эмбрионов с помощью FISH-метода (fluorescent in situ hybridization) у супружеских пар, проходящих лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).
Суть исследования
Проводили определение пола у 360 эмбрионов, полученных у 42 супружеских пар в 60 циклах стимуляции суперовуляции в программе ЭКО. После биопсии и фиксации бластомеров пригодным к проведению диагностики оказалось 281 ядро, из них 217 (77,2%) не несли хромосомной патологии. 104 ядра содержали женский набор хромосом, 113 –мужской. В 64 ядрах (22,8%) были выявлены различные виды анеуплоидии гоносом. Дальнейшее развитие эмбрионов после проведения биопсии бластомера наблюдалось в 79%.
В 10 циклах стимуляции из 60 перенос не производился в связи с отсутствием эмбрионов нужного пола. Беременность наступила в 17 циклах (28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов). Из 13 клинически подтвержденных беременностей 4 прервались в 1-ом триместре, 1 –во 2-ом. 8 беременностей закончились рождением 10 (2 двойни) здоровых детей желаемого пола.
Из 64 ядер, содержащих хромосомную патологию, 19 (29,7%) имели моносомию X-хромосомы, 8 (12,5%) – моносомию Y-хромосомы. Трисомия была отмечена в 28 случаях (43,8%), полисомия в 8 (12,5%). Таким образом, полученные данные показали, что моносомия и трисомия являются наиболее частой хромосомной патологией гоносом.
Преимплантационная генетическая диагностика (ПД) возникла более 40 лет назад. Впервые R.Edwards и R.Gardner применили ее в 1967 г. для определения пола эмбрионов кролика. Уже тогда возникла идея использования данной технологии у человека для предотвращения передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако такая возможность появилась только спустя 20 лет, когда в начале 90-х годов была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей выявлять мутации в единичных клетках [2]. Впервые ПЦР для проведения ПД в клинической практике применили A.Handyside и соавторы в 1990 г., выявив специфические последовательности для Y-хромосомы при определении пола эмбрионов у супружеских пар с X-сцепленными заболеваниями. С развитием науки от проведения ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода — флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Преимущество данного метода состояло в возможности одновременного определения как X-, так и Y-хромосомы. Кроме того, стало возможным определять не только пол эмбрионов, но и выявлять анеуплоидии половых хромосом (гоносом).
Молекулярно-цитогенетическое исследование FISH
На современном этапе развития медицины для определения пола преимплантационных эмбрионов используют молекулярно-цитогенетический метод FISH. Данный метод имеет ряд преимуществ перед другими способами молекулярной гибридизации: для генетического исследования методом FISH не требуется получения большого количества биологического материала, выделения ДНК из клеток, а также использования радиоизотопа P32. С помощью этого метода можно анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе в интерфазе. Его принцип основан на специфической гибридизации определенных участков хромосом с флюоресцентно-меченными зондами. Метод позволяет определить структурные перестройки хромосом и выявить число их копий в интерфазных ядрах по флюоресценции зондов.
ПД молекулярно-цитогенетическим FISH-методом с определением пола, выявлением анеуплоидии и различных транслокаций в эмбрионах занимает большую часть от общего числа проводимой диагностики в рамках программ ВРТ. В большинстве клиник основными показаниями для определения пола эмбрионов являются: наличие рецессивного Х-сцепленного заболевания, наличие делеций в Y хромосоме, а также желание родителей.
Исследуя пол у эмбрионов, все авторы отметили у них высокий уровень анеуплоидии гоносом и мозаицизм. По данным разных авторов, клеточный мозаицизм у преимплантационных эмбрионов может наблюдаться до 50% случаев. Эти исследования подтвердили, что высокая доля хромосомных нарушений, выявленная у эмбрионов, не связана с недостатками методики FISH, а соответствует истинному кариотипу исследуемых клеток. Полученные результаты указывают на то, что при проведении преимплантационной генетической диагностики супружеским парам с целью определения пола эмбрионов необходимо одновременно исследовать их на наиболее распространенные трисомии.
Цель исследования
Определение пола эмбрионов и выявление патологии в комплексе гоносом.
Материалы и методы
В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия НЦ АГиП им.академика В.И.Кулакова были проанализированы результаты проведения преимплантационной генетической диагностики (ПГД) с определением пола эмбрионов 42 супружеских пар по желанию пациентов. На момент исследования 2 пары были фертильны, остальные проходили лечение по программе ЭКО и ПЭ в связи с первичным или вторичным бесплодием. Средний возраст пациенток составил 32 года (от 23 до 43 лет). Исследование эмбрионов проводили с помощью FISH-метода.
Определение пола эмбриона проводили на ядрах бластомеров. Биопсия бластомера осуществлялась с помощью микроманипулятора. Для получения биологического материала прежде всего проводили пенетрацию наружной оболочки эмбриона (zona pellucida) до размера, достаточного для аспирации бластомера аспирационной микроиглой (20-40 мкм). Вскрытие zona pellucida осуществляли с помощью лазерного луча. Бластомер, содержащий четко видимое ядро, аспирировали в просвет микроиглы, соединенной с микрошприцем (50-100 мкл). Биопсированный бластомер помещали на предметное стекло, фиксировали и выполняли процесс гибридизации ДНК хромосом, содержащихся в ядре, и ДНК-зонда. Использовали зонды к X- и Y- хромосомам (фирма ABBOTT). Готовый препарат анализировали с помощью люминесцентного микроскопа (фирма Zeiss), при использовании которого каждая хромосома имеет свой, отличный от других, цвет свечения.
Результаты
Всего в 60 циклах стимуляции суперовуляции у 42 женщин было получено 520 ооцитов, после оплодотворения которых развился 371 эмбрион (71,3%). Биопсия бластомеров была проведена у 360 эмбрионов (11 эмбрионов были разрушены в ходе биопсии).
При исследовании 281 ядра, принадлежащего одноядерным бластомерам, нормальный набор по изучаемым хромосомам был определен в 217 из 281, что составило 77,2%, а в 64 отмечали различные типы анеуплоидии (22,8%). Женский набор хромосом был определен в 104 наблюдениях, мужской - в 113.
Среди выявленной патологии по изучаемым хромосомам наибольшая доля принадлежала моносомии X-хромосомы –29,7% (в 19 наблюдениях из 64). Моносомия Y-хромосомы была отмечена в 8 случаях (12,5%). Таким образом, общий уровень моносомии составил 42,2% (в 27 случаях из 64). Трисомия гоносом среди случаев выявленной анеуплоидии была отмечена в 28 наблюдениях, что составило 43,8%. Полисомия гоносом составила 12,5% (в 8 наблюдениях из 64).
После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 79% случаев. Из 60 случаев проведенной диагностики отмена переноса в связи с отсутствием нужного пола была в 10 случаях. Всего беременность наступила в 17 проведенных циклах, что составило 28% на цикл стимуляции и 34% на перенос эмбрионов. Из 13 клинических беременностей 4 остановились в развитии в 1-ом триместре беременности, 1 прервалась во 2-ом. 8 беременностей завершились родами, родилось 10 здоровых детей нужного пола (в 2-х случаях –двойни).
Выводы
Полученные нами данные показали, что проведение ПГД FISH-методом может успешно использоваться с целью определения пола эмбрионов и дальнейшего переноса в полость матки эмбриона желаемого пола. Кроме того, определение пола FISH-методом позволяет выявить патологию гоносом, что предотвращает перенос эмбриона с хромосомной патологией в полость матки пациентки, раннюю гибель эмбриона или рождение больного ребенка. Однако, учитывая наличие мозаицизма в эмбрионе, даже после проведения ПГД рекомендована пренатальная диагностика для исключения рождения ребенка с хромосомными нарушениями.
